免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位。

　　

　　一、免疫熒光技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)步驟：

　　

　　1、細(xì)胞準(zhǔn)備。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。

　　

　　2、固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。

　　

　　3、通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。

　　

　　4、封閉。使用封閉液對細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min。

　　

　　5、一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜，PBST漂洗3次，每次沖洗5min。

　　

　　6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗，室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。

　　

　　7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

　　

　　二、免疫熒光技術(shù)注意事項(xiàng)：

　　

　　1、染完之后沒有封片前直接照一些，因?yàn)橛械臅r(shí)候可能封片會(huì)出現(xiàn)問題，再想照反而沒有了，另外不要拖太長時(shí)間，熒光會(huì)崔滅的。

　　

　　2、熒光的片子一定要避光保存，保存的好的話，過一段時(shí)間仍然能照出很好的片子。

　　

　　3、二抗用之前一定離心，不然有的時(shí)候有那種沉淀，在片子上就是一個(gè)很大的非特異性熒光光點(diǎn)，非常難看。

　　

　　4、整個(gè)操作在4℃下進(jìn)行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實(shí)驗(yàn)條件是防止一抗結(jié)合細(xì)胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。

　　

　　5、洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細(xì)胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

　　

　　6、加適量正常兔血清可封閉某些細(xì)胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。

　　

　　7、細(xì)胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色?？勾銣鐒┛赡脕碇苯臃馄?20微升即可，之后片子可保留更長時(shí)間。