實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。
　　
　　檢測(cè)指標(biāo)是：各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與DNALadder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
　　
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR的廣泛應(yīng)用：
　　
　　•可以對(duì)各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析，如：同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。過去zui常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是cDNA芯片和差異顯示，但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時(shí)PCR技術(shù)和高通道實(shí)時(shí)PCR儀的出現(xiàn)，無疑為這種檢測(cè)提供了極大的方便。
　　
　　•可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析，用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記Taqman探針，然后分別與野生型和突變型雜交，如果一種熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種熒光信號(hào)，則表明它是純合子；如果兩種熒光信號(hào)都明顯增強(qiáng)，則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)（MolecularBeacon）就是專門為這種技術(shù)設(shè)計(jì)的探針。
　　
　　•可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義，因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性，一旦SNP的序列信息是已知的，采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的SNP檢測(cè)將會(huì)變得簡單而準(zhǔn)確。
　　
　　•可以進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè)，DNA甲基化同人類的許多疾病有關(guān)，特別是癌癥，Laird報(bào)道了一種稱作Methylight的技術(shù)，在擴(kuò)增之前先處理DNA，使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影響，用特異性的引物和Taqman探針來區(qū)分甲基化和非甲基化的DNA，這種方法不僅方便而且靈敏度更高。
　　
　　•對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析，這在我國應(yīng)用比較廣泛，大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床PCR試劑的廠商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑，如：肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。
　　
　　•閃晶生物同時(shí)提供藥物伴隨診斷(companiondiagnostic)方法如EGFR、BRAFV600E突變、HER2擴(kuò)增、BCR-Abl、PML-RAR、ALK融合基因等。